• Главная
• Новое
• Популярное
• Поиск
• Карта
• Связь

Материалы и методы

Экспериментальная генетика и физиология / Территориальное размещение бурых лягушек в период размножения / Материалы и методы

Страница 1

Материалом для исследования послужили растения овсяницы луговой Festuca pratensis Huds. Одна группа растений представляла собой мутантные популяции, полученные после обработки семян химическими (этилметансульфонат — ЭМС, этиленимин — ЭИ и азид натрия — NaN3) мутагенами независимо и в комбинации с гамма-облучением (Олимпиенко, Лебедева, 1985). Мутантные популяции культивировали на протяжении пяти семенных поколений, анализируя в каждом из них уровень фертильности пыльцы.

Вторую группу составили растения, характеризующиеся появлением у проростков, выращенных при высокой температуре (35°C) и постоянном освещении, разнообразного спектра хлорофильных мутаций (Land et al., 1971). Это особый класс пигментных мутаций, которые не обнаруживаются в естественных условиях, вследствие деятельности гена-супрессора, маскирующего первичные мутации (Титов и др., 1978; Олимпиенко и др., 1982). В определенных экстремальных условиях функция его подавляется (Инге-Вечтомов и др., 1994), и весь спектр хлорофильных изменений может быть оценен визуально. При переходе к нормальным температурным условиям (25°C) у проростков происходило восстановление (реверсия) пигментации к дикому типу (зеленая окраска первого листа). Степень хлорофильного дефекта и его восстановление маркировали по общепринятой классификации (Калам, Орав, 1974). Растения объединяли в 7 групп соответственно типу депигментации их проростков: V — виридис, УМ — виридо-норма, УХ — виридо-ксанта, X — ксанта, ХМ — ксанта-норма, XV — ксанта-виридис, А — альбина. Ревертанты разделяли на две группы: с быстрым восстановлением к дикому типу (в течение 4 дней проращивания при 25°С), маркированные как У>М — вирида-до нормы, Х>М

— ксанта до нормы, А>У — альбина до виридис и с медленным (более 14 дней), обозначенные как У>У — виридо-нет, Х>Х — ксанта-нет, А>А

— альбина-нет. Исходно зеленые проростки представляли собой дикий тип — W-type (М, норма). Взрослые особи, выращенные из маркированных проростков, рассматривались нами как растения-ревертанты и культивировались в полевых условиях в течение 7 лет в виде 110 клонов (8 растений в каждом ряду с расстоянием 60x60 см). Клонировали (вегетативное размножение) делением материнских растений.

Фертильность пыльцы изучали на протяжении 6 вегетационных периодов (1997-2002 гг.). Во время цветения пыльники фиксировали в 700 спирте. Уровень фертильности (жизнеспособности) пыльцевых зерен оценивали по интенсивности окрашивания их раствором 1% ацетокар-мина. К группе фертильных относили пыльцу, содержащую два спермия и вегетативную клетку с окрашенной в темно-розовый цвет зернистой цитоплазмой. Стерильной считалась сморщенная, неокрашенная, с видимыми повреждениями пыльца. Общее число пыльцевых зерен (до 2000 для каждого варианта) просматривали в 50 полях зрения микроскопа.

Для оценки достоверности различий между контролем и мутантными популяциями и между растениями-ревертантами по процентному содержанию фертильной пыльцы использовали критерий Стьюдента. При оценке влияния различных факторов (поколение, возраст растений, мутагенн